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              ELISA試劑盒的制備過程

              發布時間: 2022-04-13  點擊次數: 1228次

              一、ELISA試劑盒的組成

              完整的ELISA試劑盒包含以下各組分:

              (1)已包被抗原或抗體的固相載體(免疫吸附劑);

              (2)酶標記的抗原或抗體(結合物);

              (3)酶的底物;

              (4) 陰性對照品和陽性對照品(定性測定中),參考標準品和控制血清(定量測定中);

              (5)結合物及標本的稀釋液;

              (6)洗滌液,在板式ELISA中,常用的稀釋液為含0.05%吐溫20磷酸緩沖鹽水;

              (7)酶反應終止液,常用的HRP反應終止液為硫酸,其濃度按加量及比色液的最終體積而異,在板式ELISA中一般采用2mol/L。

               

              二、ELISA試劑盒的包被方式

              將抗原或抗體固定在過程稱為包被(coating)。換言之,包被即是抗原或抗體結合到固相載體表面的過程。蛋白質與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結合的,靠的是蛋白質分子結構上的疏水基團與固相載體表面的疏水基團間的作用于。

              這種物理吸附是非特異性的,受蛋白質的分子量、等電點、濃度等的影響。載體對不同蛋白質的吸附能力是不相同的,大分子蛋白質較小分子蛋白質通常含有更多的疏水基團,故更易吸附到固相載體表面。

              IgG對聚苯乙烯等固相具有較強的吸附力,其聯結多發生在Fc段上,抗體結合點暴露于外,因此抗體的包被一般均采用直接吸附法。蛋白質抗原大多也可采用與抗體相似的方法包被。

              當抗原決定簇存在于或鄰近于疏水區域時,抗原與固相載體的直接吸附可使抗原決定簇不能充分暴露,在這種情況下,直接包被效果不佳,可以采用間接的捕獲包被法,即先將針對該抗原的特異抗體作預包被,其后通過抗原抗體反應使抗原固相化。

              此間接結合在固相上的抗原遠離載體表面,其抗原決定簇也得以充分暴露。間接包被的抗原經固相抗體的親和層析作用,包被在固相上的抗原純度大大提高,因此含雜質較多的抗原也可采用捕獲包被法,試驗的特異性、敏感性均由此得以改善,重復性亦佳。

              間接包被的另一優點是抗原用量少,僅為直接包被的1/10乃至于/100。不易吸附在聚苯乙烯載體上的非蛋白質抗原可采用特殊的包被方式。例如,在檢測抗DNA抗體時,需用DNA作為包被抗原,而普遍的固相載體一般不能直接與核酸結合。

              可將聚苯乙烯板先經紫外線照射(例如30W紫外燈,75cm照射12h),以增加其吸附性能。固相載體先用堿性蛋白質,如聚賴氨酸、魚精蛋白等作預包被,也可提高核酸的結合力。也可用親和素生物素系統作間接包被,即用親和素先包被載體,然后加入生物素化的DNA,這種包被方法均勻、牢固,已擴大應用于各種抗原物質的定量測定。

              脂類物質無法與固相載體結合,可將其在有機溶劑(例如乙醇)中溶解后加入ELISA板孔中,開蓋置冰箱過夜或冷風吹干,待酒精揮發后,讓脂質自然干固在固相表面??剐牧字贵w的ELISA試劑一般采用這種包被方式。

               

              三、ELISA試劑盒的包被條件與封閉

              包被用抗原或抗體的濃度,包被的溫度和時間,包被液的pH等應根據試驗的特點和材料的性質而選定??贵w和蛋白質抗原一般采用pH9.6的碳酸鹽緩沖液作為稀釋液,也有用pH7.2的磷酸鹽緩沖液及pH7~8的Tris-HCL緩沖液作為稀釋液的。

              通常在ELISA板孔中加入包被液后,在4-8℃冰箱中放置過夜,37℃中保溫2h被認為具有同等的包被效果。包被的適當濃度隨載體和包被物的性質可有很大的變化,每批材料需通過實驗與酶結合物的濃度協調選定。一般蛋白質的包被濃度為100ng/mL-20ug/mL。

              封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度的無關蛋白質溶液再包被的過程??乖蚩贵w包被時所用的濃度較低,吸收后固相載體表面尚有未被占據的空隙,封閉就是讓大量不相關的蛋白質充填這些空隙,從而排斥在ELISA其后的步驟中干擾物質的再吸附。封閉的手續與包被相類似。

              常用的封閉劑是0.05%-0.5%的牛血清白蛋白,也有用10%的小牛血清或1%明膠作為封閉劑的。脫脂奶粉也是一種良好的封閉劑,其最大的特點是價廉,可以高濃度使用(5%)。

              高質量的速溶食用低脂奶粉即可直接當作封閉劑使用,但由于奶粉的成份復雜,而且封閉后的載體不易長期保存,因此在試劑盒的制備中較少應用。

              封閉是否必要,取決于ELISA的模式及具體的實驗條件。并非所有的ELISA固相均需封閉,封閉不當反而會使陰性本底增高。一般說來,雙抗體夾心法,只要酶標記物是高活性的,操作時洗滌徹底,不經封閉也可得到滿意的結果。

              特別是用單抗腹水直接包被時,因其中大量非抗體蛋白在包被時同樣也吸附在固相表面,業已起到了類似封閉劑的作用。但在間接法測定中,封閉一般是不可少的。包被好的ELISA板干燥后放入密封袋或錫袋中,在低溫可保存數月。


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