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              一文與大家分享熒光定量PCR試劑盒的反應流程

              發布時間: 2022-07-26  點擊次數: 105次
                熒光定量PCR試劑盒的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。進行檢測時,樣品中的受檢物質(抗原或抗體)與固定的抗體或抗原結合。通過洗板除去非結合物,再加入酶標記的抗原或抗體,此時,能固定下來的酶量與樣品中被檢物質的量相關。通過加入與酶反應的底物后顯色,根據顏色的深淺可以判斷樣品中物質的含量,進行定性或定量的分析。
               
                今天要與大家分享的是熒光定量PCR試劑盒的反應流程,希望能夠幫助到您:
               
                1、將PCR反應所需的成分配置完后,在PCR儀上于94-96℃預加熱幾十秒至幾分鐘,使模板DNA充分變性,然后進入擴增循環。在每一個循環中,先于94℃保持30秒鐘使模板變性,然后將溫度降到復性溫度(一般50-60℃之間),一般保持30秒鐘,使引物與模板充分退火;在72℃保持1分鐘(擴增1kb片段),使引物在模板上延伸,合成DNA,完成一個循環。重復這樣的循環25~35次,使擴增的DNA片段大量累積。最后,在72℃保持3-7min,使產物延伸完整,4℃保存。
               
                2、復性和延伸溫度
               
                復性的溫度是PCR擴增是否順利的關鍵因素,通常在50-60℃之間。具體的溫度主要由引物的Tm值決定。延伸溫度絕大多數設定為72℃。如果復性的溫度很高,可以將延伸溫度和復性溫度設置成同一溫度,變成二步法PCR。
               
                3、反應時間
               
                變性步驟一般使用30秒鐘,如果模板的G+C含量較高,或直接用細胞做模板,變性時間可適當延長。復性時間有30秒種一般是足夠的。延伸時間由擴增產物的大小決定,一般采用1kb用1分鐘來保證充足的時間。
               
                4、循環次數
               
                循環次數主要與模板的起始數量有關,在模板拷貝數為104~105數量級時,循環數通常為25~35次。

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