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              熒光定量PCR試劑盒熔解曲線出現多峰的原因及解決方法介紹

              發布時間: 2022-07-04  點擊次數: 139次
                熒光定量PCR是目前分子生物學研究中常使用的技術手段之一,熒光定量PCR試劑盒反應特異性高,能有效避免非特異擴增,提高實驗效率。結合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性,酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性,又保留酶的活性。
               
                下面咱們來了解下熒光定量PCR試劑盒熔解曲線出現多峰的原因及解決方法:
               
                較為理想的熔解曲線是單峰曲線,如出現多峰有以下原因:
               
                1、非特異性擴增:主要原因為引物特異性不好、Tm值較低或模板質量不高,可以根據設計原則設計新引物或者通過梯度PCR對引物退火溫度(Tm值)進行優化,上調Tm值,選購質量較好的離心柱法核酸提取試劑,提高核酸提取質量,等等。
               
                2、引物二聚體可通過瓊脂糖凝膠電泳確認引物二聚體。引物二聚體在凝膠的底部形成擴散條帶,通常位于100bp以下。引物二聚體在熔解曲線內峰值一般位于75℃左右,如該峰顯著請按照以下方面進行優化:
               
               ?。?)優化擴增條件,如提高退火溫度,可利用梯度PCR,摸索Tm值。通常兩步循環(由95℃變性步驟直接進入60℃退火和延伸步驟)有利于強效擴增,因此引物設計時設定的成功退火溫度為60℃。
               
               ?。?)引物濃度太高,適當降低引物濃度。通常引物的Tm低于目的基因,熔解曲線上峰值在目的基因峰的左邊。大多數情況下,每條引物的理想濃度為200nM,但如有需要,可將濃度降至60nM。
               
               ?。?)cDNA模板帶有基因組DNA污染:重新制備cDNA模板。在RNA提取完成后加入DNase對RNA進行處理,然后逆轉錄為cDNA。
               
                如果排除以上原因還是出現熔解曲線多峰的情況,就要考慮及時更換試劑盒,避免耽誤實驗進度。

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